一、实验简介

细胞成球实验（sphere-formation assay）又称球囊悬浮实验，让单细胞在非贴壁依赖培养条件中培养，大部分细胞因缺乏贴壁条件而凋亡，而部分具有干性的细胞能够聚集成团形成三维球体结构，且能在体外进行多次传代。通过细胞成球实验可以评估细胞的自我更新能力，模拟体内三维微环境，研究细胞增殖、分化和药物反应。

二、实验流程

（一）一次成球

1、单细胞悬液制备：对数生长期细胞胰酶消化后离心，PBS清洗2次，用干细胞培养基轻轻吹打重悬细胞并计数。

（干细胞培养基：DMEM/F12或1640培养基，含有1×B27营养液、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和5μg/ml胰岛素）

2、细胞铺板：选择超低吸附细胞培养六孔板，每孔1000个细胞（500-5000个，取决于细胞的成球能力），补加3ml培养基。

3、细胞球培养:5%CO2 37℃培养箱中培养7-10天，每隔2-3天半量换液。显微镜下观察细胞成球情况和形态。

（二）二次成球

1、收集细胞球：收集一次成球得到的细胞球，离心去上清，胰酶消化，终止消化，离心去上清，PBS清洗2次，干细胞培养基轻轻吹打重悬细胞并计数。

2、细胞铺板：选择超低吸附细胞培养六孔板，每孔1000个细胞（500-5000个，取决于细胞的成球能力），补加3ml培养基。注意铺板的细胞数量应与一次成球铺板的细胞数量相同；

3、细胞球培养:5%CO2 37℃培养箱中培养7-10天，每隔2-3天半量换液。显微镜下观察细胞成球情况和形态。

（三）结果处理与分析

在细胞成球达到理想状态后，可以进行各种实验处理和分析。

1、可以添加药物或生物活性物质，观察对成球形态和细胞功能的影响；

2、可以进行基因表达分析，研究成球中特定基因的表达水平变化;

3、可以进行细胞增殖、分化或凋亡等功能实验。

三、联系咨询

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