产品描述：

外泌体(Exosomes)是一种直径为30-200nm的微小囊泡，可由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液中。外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息。目前外泌体提取主要有超速离心、试剂盒提取等方法。其中通过超速离心法分离得到的外泌体纯度高，可满足于后续不同实验的需求，但是仪器要求高，周期长，工作量大。

本试剂盒可以快速从乳液中获得大量完整的外泌体颗粒，实验室普通离心机就可以完成，提取的外泌体适用于下游的细胞共培养、电镜、分析、Western Blot、qPCR和高通量测序等应用。

使用说明：

一、乳液样本预处理：

1、收集新鲜的乳液样本，置于冰上待用；若为冻存样品，可25℃水浴解冻，待完全融化后置于冰上待用（建议单次提取的乳液量为25-50ml）。

2、离心去脂：将样品转移至离心管中，于4℃，10,000×g离心30min。离心后样品分为三层，上层为脂质层，下层为蛋白沉淀，中间层为乳清。离心后上层的状态应为“致密、稳定、不易脱落”，若上层“松软、易脱落”且下层沉淀较多，可重复此离心步骤，每次离心后取中间层的乳清，去除样品上层的脂质和下层的部分蛋白。

3、乳清转移：将去除脂质的乳清（中间层液体）转移至新的50ml离心管中（注：可用枪头将上层脂质戳破后缓慢倾倒，或用移液器转移，转移后的乳清中带有少量脂质和蛋白沉淀是正常现象，不影响后续实验）。

二、去除杂蛋白

1、澄清乳清：乳清中加入1/10乳清体积的试剂A，将离心管颠倒数次混匀。再加入1/8倍乳清体积的试剂B，颠倒数次混匀后静置于4℃ 冰箱中5min（注：乳清:试剂A :试剂B=20:2:2.5）。静置完成后轻轻晃动离心管，会呈现“豆花状”固体，液体部分为“透明状”。若未呈现“豆花状”，可适当加入试剂B混匀后轻晃管壁至有“豆花状”固体出现。

2、离心去蛋白：将澄清后的乳清于4℃，10,000×g离心20min，去除杂蛋白沉淀，收集上清液（注：若上清可见白色颗粒，建议重复此步骤，避免下一步离心过滤困难）。

3、过滤：将收集的上清液转移至50ml离心过滤柱中，于4℃，3000×g离心10min，收集滤液（注：若未过滤完，可重复离心至上层液体全部离下来为止。50ml离心过滤柱为一次性耗材，不建议重复使用）。

4、缓冲体系平衡：将滤液转移至新的50ml离心管中，加入与试剂B等体积的试剂C，颠倒混匀（注：加入试剂C的剂量和试剂B剂量保持一致）。

三、外泌体提取：

1、加入外泌体提取液：在含有试剂C的滤液加入1/4乳清体积的试剂D，涡旋振荡1min充分混匀后，静置于4℃冰箱中4h以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过24h）。

3、离心：取出装有混合液的离心管，4℃，10,000×g离心30min，弃上清，收集富含外泌体的沉淀。

4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于4℃，3000×g离心5min，弃上清，请尽可能吸尽上清液。

5、重悬：取适量的1×PBS吹打重悬沉淀，并转移至新的1.5ml离心管中（建议每20ml乳清用200μl左右的1×PBS重悬）。

6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5ml离心管于4℃，10,000×g离心2min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（若沉淀较多，重复离心操作多次至无明显沉淀，每次离心后取上清液）。

7、外泌体溶液可能带有淡淡的乳白色，为正常现象。如果外泌体需要无菌处理，可用0.45μm过滤器过滤后使用。外泌体可于4℃保存3天，-80℃长期保存，建议外泌体分装后保存，避免反复冻融。

注意事项：

1、本产品只针对乳液来源的外泌体分离，不适用其他来源的外泌体抽提。

2、本产品仅作体外科研使用，不可用于临床诊断或治疗。

3、实验员请穿实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

保存方法：

常温保存，一年有效。

使用范围：

仅限科研使用，不能应用于临床。