一、实验简介

免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（（荧光素、酶、金属离子、同位素））显色，从而对组织或细胞内的特定抗原（如蛋白质、多肽等）进行定位、定性及相对定量研究的一种技术，被称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

二、实验流程

1、组织固定：离体组织立即用组织固定液固定12-24h。

2、石蜡包埋与切片：固定后的组织经脱水、透明后浸蜡包埋，然后用切片机切成薄片，贴在载玻片上。

3、脱蜡与水化：切片依次浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ以去除石蜡，经梯度酒精脱水，蒸馏水清洗。

4、抗原修复：常使用热修复法或者酶修复法暴露抗原表位。可将切片浸入枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 8.0-9.0），使用微波炉加热至92-95℃并维持一段时间。修复后冷却至室温，PBST洗涤。

5、画圈隔离：用免疫组化笔在载玻片上组织周围画圈，提供疏水性屏障。

6、封闭：3%双氧水室温孵育10-20min以封闭内源性过氧化物酶。BSA溶液室温20-30min以封闭非特异性结合位点。

7、抗体孵育：PBST洗涤，滴加稀释好的一抗，室温孵育1-2小时或4℃过夜。PBST洗涤，滴加稀释好的二抗，室温孵育30min。

8、显色/复染：PBST洗涤后，滴加DAB显色液，显微镜观察控制时间，自来水终止反应。苏木素对细胞核进行复染,自来水冲洗15min。

9、封片观察：切片经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片。光学显微镜下观察，阳性信号通常为棕黄色，细胞核呈蓝色。

三、注意事项

1、我们接收固定完全的组织，石蜡或OCT冰冻包埋块，石蜡或冰冻切片。固定样本、石蜡包埋块及石蜡切片常温运输，冰冻包埋块和冰冻切片干冰运输。

2、组织离体后，选择合适的固定液和容器立即固定。要保证组织在容器内不贴壁或挤压，固定液用量建议大于组织体积的10-15倍，固定时间建议12-24h，具体应根据组织类型和大小而定。标本常温（25℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰。固定样本常温运输送样。运输过程中务必做好标识，避免样本混淆。

3、如果一只动物同时取多种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官（脑，脊髓等），皮肤、肌肉等可最后取。

4、石蜡切片和冰冻切片都适用于大部分实验，针对常规染色、组化或荧光推荐选择石蜡切片，因为石蜡切片对组织的形态保存比冰冻切片好，并且对抗原基本无影响。

5、如果标本已经-80℃冷冻了，但又想要做石蜡切片，标本千万不要解冻，应直接放于固定液内固定(在固定液内边解冻边固定)。

四、联系咨询

攸碧艾欢迎您来电咨询实验服务，联系电话：400-681-8582。